El proceso de evangelización fue liderado por el clero regular,integrado por frailes y monjas que residian en conventos o monasterios. Las órdenes religiosas estaban sujetas a sus propias reglas y principios, como la humildad y la caridad, pero subordinadas directamente al papa y supervisadas por la Corona mediante el Patronato Real. La llegada de los primeros misioneros a América, los franciscanos, ocurrió en 1524. En 1526 llegaron los dominicos; los agustinos en 1533, y los jesuitas en 1572.
Los frailes desempefaron un papel importante en la evangelización de los indigenas. Además de su labor religiosa, se encargaron de la educación, la ensefanza de oficios y la protección de los nativos. La evangelización eliminó poco a poco las formas de vida prehispánicas para establecer una norma cristiana como único modo de vida concebible. Para convertir a los indígenas se utilizaron diversos métodos, incluso violentos, como el sometimiento y la destrucción de templos, de esculturas y de códices. La evangelización se centró en la conversión del "otro", considerado pagano si no cumplia con los principios del cristianismo.
Algunos frailes adoptaron una perspectiva distinta y creyeron en el poder del ejemplo y la predicación para lograr la conversión religiosa; se centraron en la educación y la organización comunitaria, se esforzaron por aprender las lenguas indigenas y adquirir conocimientos sobre su historia y costumbres. Fray Bernardino de Sahagún fue un ejemplo de ello. Él consideró que el conocimiento de las creencias y tradiciones indigenas era fundamental para combatir la idolatría, a la que comparaba con una enfermedad. Sahagún plasmó esta información en su obra Historia general de las cosas de Nueva Espana.
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